Фото: із відкритих джерел
Науковці з Kansas State University повідомили, що два поширені вірусні білки — HcPro і P19 — здатні пригнічувати активність CRISPR-Cas13, який розглядають як інструмент для створення стійкості культур до РНК-вірусів. Результати отримали в модельній рослині Nicotiana benthamiana та опублікували в журналі Stress Biology.
Про це повідомляє сайт Аграрії разом з посиланням на сайт Global Agriculture.
Дві відомі вірусні білкові молекули, які допомагають рослинним вірусам обходити природний імунітет рослин, можуть також «вимикати» перспективний інструмент РНК-редагування CRISPR-Cas13. Про це йдеться в роботі дослідників Kansas State University (команда під керівництвом професора фітопатології David Cook), опублікованій у журналі Stress Biology.
Cas13 відрізняється від більш відомого CRISPR-Cas9 тим, що націлений не на ДНК, а на РНК. Саме тому його розглядають як потенційну основу для створення широкої стійкості до вірусів, геном яких представлений РНК (зокрема потівірусів і вірусів типу tomato spotted wilt). Концепція полягає в тому, що Cas13, запрограмований направляючою РНК (guide RNA) під конкретну послідовність вірусу, має руйнувати вірусну РНК під час реплікації. Однак нові дані показують, що віруси можуть мати власні механізми протидії такому підходу.
Як проводили експеримент
Досліди виконували на Nicotiana benthamiana — модельній рослині, яку широко використовують у вірусології та біотехнології. Для швидкого введення генетичних конструкцій у листки застосували агроінфільтрацію (введення в тканину листка розчину модифікованих ґрунтових бактерій).
У рослинах експресували фермент Cas13 (LbuCas13) разом із направляючими РНК, які були спроєктовані:
- для націлювання на фрагмент вірусу Turnip mosaic virus;
- окремо — на власний ген рослини phytoene desaturase (PDS), який часто використовують як лабораторний маркер: його «вимкнення» робить тканину листка помітно блідою, що дозволяє візуально відстежувати ефект сайленсингу.
Паралельно з Cas13 дослідники коекспресували один із двох вірусних білків:
- HcPro (характерний для потівірусів);
- P19 (характерний для томбусвірусів).
Обидва білки відомі як супресори РНК-сайленсингу: з точки зору вірусу вони пригнічують природні механізми РНК-інтерференції в рослині, що полегшує реплікацію патогена. Контролем у досліді слугував білок GUS, не пов’язаний із цими механізмами.
Щоб оцінити, чи працює Cas13, команда відстежувала рівні білків за допомогою Western blot, а рівні транскриптів — методами кількісної ПЛР та Northern blot.
Що саме виявили
За даними авторів, і HcPro, і P19 блокували здатність Cas13 пригнічувати заплановані мішені — зокрема й маркерний ген PDS. Тобто в присутності цих вірусних супресорів Cas13 фактично втрачав функціональність у системі, яку тестували.
Щоб перевірити, з чим пов’язаний ефект, дослідники використали мутантну версію HcPro — AS9, яка втратила активність супресора РНК-сайленсингу, але загалом залишається подібною до «звичайного» білка. Цей мутант, як зазначено в матеріалі, не блокував Cas13. На думку авторів, це вказує, що саме супресорна активність HcPro/P19 є ключовою для нейтралізації Cas13.
Як можливе пояснення механізму в роботі обговорюють гіпотезу: оскільки направляючі РНК Cas13 і малі РНК природних шляхів сайленсингу мають структурні подібності, вірусні супресори можуть «перехоплювати» guide RNA так само, як вони зв’язують/порушують роботу малих РНК у природному антивірусному захисті рослин.
Що це означає для розробки вірусостійких культур
Практичний висновок, який випливає з опису дослідження, радше застережний: віруси, проти яких намагаються створити Cas13-захист, можуть мати вбудовані білкові інструменти, здатні цей захист нейтралізувати. У матеріалі підкреслюється, що конструкція Cas13, яка демонструє ефективність проти ослабленого лабораторного варіанта вірусу, може не спрацювати проти польового штаму з повноцінним супресором РНК-сайленсингу.
Автори також зазначають, що майбутні антивірусні дизайни на основі Cas13 можуть потребувати або модифікації структур направляючих РНК, щоб зменшити їхню вразливість до супресорів, або поєднання Cas13 з іншими механізмами стійкості, а не використання як єдиного бар’єра.
У ширшому контексті джерело нагадує, що РНК-віруси є суттєвим чинником втрат урожаю в багатьох регіонах, а потівіруси та томбусвірус-споріднені хвороби уражують низку культур (зокрема овочеві). Тому результати базового дослідження можуть бути корисними як ранній сигнал для програм, що розробляють генетичну вірусостійкість: у конструкціях варто одразу враховувати можливі «контрзаходи» з боку вірусу.